イントロダクション

金属ナノ粒子を用いた蛍光分光は、局在表面プラズモン共鳴（LSPR：Localized surface plasmon resonance）による電場増強効果によって標識分子の蛍光強度を増強できるため、高感度な光バイオセンシング技術として注目を集めています。

LSPR の共鳴波長は金属ナノ構造の大きさや形状、金や銀などの金属の種類、さらには金属表面近傍における物質の吸脱着や周辺媒質の屈折率により変わります。LSPR バイオセンサーでは、検出対象の物質と結合するリガンド分子を金属表面に塗布しておくことで、両者の結合をスペクトルの変化として検出します。

金属ナノ粒子のバイオセンシングへの応用を進めるためには、粒子一つひとつの光学特性のばらつきを評価することが大切です。そのためには、ナノスケールの微粒子をとらえる暗視野観察と散乱光や蛍光の分光測定が欠かせません。これらの機能を併せ持つ暗視野分光イメージング顕微鏡は、バイオセンシング技術の開発におけるパワフルな分析ツールとして期待されています。

このアプリケーションノートでは、サイエンスエッジ社製の暗視野分光イメージング顕微鏡InFocus λ DS を使用して、ポリマー被覆銀ナノ粒子によるプラズモン増強散乱光および蛍光の暗視野分光イメージングを行いました。

試料準備

蛍光分子が金属表面に近接すると、電場増強効果が増大する一方で、金属表面のエネルギー移動によって消光効果が生じます。この消光効果を抑制しながら高い電場増強効果を得るために、金属ナノ粒子の表面に数nm 程度のスペーサー膜を形成する手法が知られています。

ここでは、直径80 nm の銀ナノ粒子に、厚み４ nm の機能性ポリマーが被覆された試料をInFocus λ DS を用いて測定し、単離された銀ナノ粒子の暗視野顕微鏡画像の観察および増強された暗視野散乱スペクトルの分光測定を行いました。さらに、蛍光色素分子（Alexa Fluor: λex = 430 nm, λem = 540 nm）により修飾されたポリマー被覆銀ナノ粒子について、表面プラズモン励起増強蛍光分光（SPFS：Surface plasmon-field enhanced fluorescencespectroscopy）の測定を行いました（図１）。

暗視野分光測定

暗視野分光イメージング顕微鏡InFocus λ DSの装置構成を図２に示します。リング絞りと穴あきミラーを用いて、リング状の白色LED 照明光を直接観察光学系に入らないように斜めに照明します。暗視野顕微鏡下で高速にハイパースペクトルイメージングをするために、分光器のスリット方向を空間情報に使い、指定した測定エリアのX軸の分光測定を一度に行います（ライン検出）。ガルバノスキャナにより検出位置をY軸方向に走査しながら測定を繰り返すことで、暗視野分光イメージングを高速に実行できます。256 x 1024画素の電子冷却CCDにより、空間方向においてもスペクトル方向においても、大量のデータを取得できます。

取得した暗視野分光イメージの任意の場所をクリックすることで、その場所のスペクトル情報を確認できます。任意のバンドに擬似カラーを割り当てることで、マルチカラーの暗視野分光画像を生成することができます。